STARTING 152648

A projekt tartalmának bemutatása:

A növények számos védekező mechanizmust alkalmaznak a vírusfertőzések korlátozására, amelyek közül az RNS csendesítés a legismertebb. A veleszületett immunitás aktiválódása gyakran helyi és szisztémás nekrózist eredményez, amelyek korlátozzák a vírus terjedését és a szervezet nem fertőzött távoli részeiben rezisztencia kialakulásához vezethetnek. Az RNS-csendesítéssel ellentétben ez utóbbi folyamatok részletei és szabályozása még csak korlátozottan ismert. A szisztémás nekrózis (SN), a lokális túlérzékenységi válasz (HR) speciális formájának tekinthető. Az SN a szár csúcsi szakaszának a nekrózisával jár, ami sokszor a növény pusztuláshoz vezet. A CRISPR/Cas9 genomszerkesztő rendszer segítségével korábban ago2 és rdr6 mutáns Nicotiana benthamiana vonalakat állítottunk elő. Mindkét mutáns fokozott érzékenységet mutat a PVX fertőzéssel szemben, míg azonban az ago2 növényekben a fertőzés szinte mindig SN-t eredményez, ez a válasz ritkán figyelhető meg az rdr6 növényekben. Egyik fő célkitűzésünk az eltérő válaszok molekuláris alapjainak a feltárása. Ezt a célt modern, új generációs szekvenálás és genomszerkesztés felhasználásával fogjuk elérni. Nemrégiben kimutattuk, hogy a kettős szálú RNS-kötő fehérje, a DRB2 részt vesz a vírus indukálta nekrózisban. Ennek a folyamatnak a hátterét is szeretnénk megismerni. A fentiek alapján célkitűzéseink a következők:
(1) Korábban elvégeztük a PVX-fertőzött vad típusú és ago2 mutáns növények összehasonlító transzkriptóm elemzését azzal a céllal, hogy a vírus indukálta nekrózisban résztvevő géneket azonosítsunk. Ezekre az adatokra támaszkodva olyan géneket keresünk, amelyek kifejeződése csak az egyik genotípusú növényben változik. Ezek között lehetnek olyan gének, amelyek az ago2 növény PVX fertőzése során fellépő SN kialakulásában szerepet játszanak. Ennek a hipotézisnek a tesztelése az egyik fő célunk. Az adatok előzetes értékelése során már több ígéretes jelölt gént azonosítottunk. Közülük többről tudott, hogy különböző stressz válaszokban részt vesznek, de vannak olyanok is, amelyeknek még nincs ismert funkciója. A kiválasztott gének expressziós változásait qRT-PCR-rel fogjuk megerősíteni. Ezt követően a legígéretesebb jelölteket CRISPR/Cas9 segítségével inaktiváljuk, majd a mutáns növények vírusfertőzésre adott válaszait vizsgáljuk. A kísérletek eredményeitől függően további funkcionális vizsgálatokat fogunk végezni.
(2) Az ago2 és az rdr6 növények PVX-fertőzésre adott eltérő válaszainak a megértése érdekében a két növényvonal összehasonlító transzkriptóm elemzését fogjuk elvégezni. Olyan géneket keresünk, amelyek jelentős (legalább 2-3-szoros) expressziós eltérést mutatnak a fertőzött és a nem fertőzött növények között. Ezek közül főleg azokra összpontosítunk, amelyek kifejeződése a különböző genotípusokban is jelentősen eltér. Mivel a vírus indukálta SN főleg az ago2 növény csúcsi régiójában figyelhető meg, az ismert merisztéma-specifikus funkciókkal bíró géneket alaposabban megvizsgáljuk majd. A gének expressziós változásait qRT-PCR segítségével megerősítjük. A kiválasztott géneket genomszerkesztéssel elrontjuk, vagy expressziójukat VIGS segítségével csökkentjük. A létrejövő növény vonalakat további funkcionális vizsgálatoknak vetjük alá. Az ago2 és az rdr6 növények génexpressziós mintázatainak összehasonlító elemzése várhatóan lehetővé teszi majd az antivirális RNS csendesítésében és a vírus indukálta nekrotikus válaszokban differenciáltan részt vevő gének azonosítását.
(3) Dupla szálú RNS (dsRNS) a sejtben vírusreplikáció során képződik, ezért a kórokozók jelenlétéhez kapcsolódó molekuláris mintaként (PAMP) szolgálhat. Állati sejtekben a virális dsRNS-eket specifikus receptorok ismerik fel (TLR, RIG-I), amelyek aktiválódása különböző PTI-válaszokat eredményez. A közelmúltban megerősítést nyert, hogy a dsRNS-ek a növényekben is PAMP-ként működhetnek, azonban a dsRNS-kötő receptort még nem azonosították. Megállapítottuk, hogy a DRB2 kifejeződés csökkentése gátolja az SN kialakulását a PVX-fertőzött ago2 mutáns N. benthamianában. Ez a megfigyelés arra utalhat, hogy a DRB2 hiányában a növény nem képes a vírust kórokozóként felismerni. A DRB2 funkcióinak a további vizsgálatára drb2 mutáns N. benthamiánát fogunk előállítani CRIPSR/Cas9 segítségével. A mutáns vírusfertőzésre adott válaszait jellemezni fogjuk. A DRB2 fehérje tulajdonságait, elsősorban RNS kötő képességét in vitro is vizsgálni kívánjuk. Ez segíthet feltárni a DRB2 azon képességének a szerkezeti alapjait, hogy replikálódó vírusok jelenlétében képes nekrózist indukálni. A DRB2-függő nekrótikus útvonal „downstream” komponenseinek az azonosításához a DRB2-vel kölcsönható fehérjéket is azonosítunk majd, amihez a hagyományos affinitás tisztításhoz kapcsolt MALDI-TOF tömegspektrometriát és/vagy az in vivo biotinilációval kapcsolt tömegspektrometriát (PL-MS) fogjuk használni. Az azonosított DRB2-kötő fehérjék génjeiben mutációkat fogunk létrehozni CRISPR/Cas9 felhasználásával. A mutánsokat jellemezni fogjuk és a gének genetikai kölcsönhatásait az RNS-csendesítő útvonal más komponenseivel vizsgáljuk. Elemzéseink eredményei alapján további kísérleteket fogunk majd végezni.
A javasolt kísérletekben modell rendszerként elsősorban az N. benthamianát fogjuk használni. Támaszkodni fogunk a laboratóriumunkban az évek során kifejlesztett jelentős technikai és genetikai erőforrásokra. A projekt sikeres megvalósítása - alapvető tudományos értéke mellett - kedvező gyakorlati következményekkel is járhat. Az N. benthamiana a burgonyafélék családjának tagjaként elterjedt modellje a paradicsom, a burgonya, a paprika és a dohány fertőző betegségeinek. Tekintettel e növények gazdasági jelentőségére, nagy fontossággal bír vírusos betegségeik jobb megértése és az ellenük való küzdelem hatékonyabb módjainak keresése.
Várhatóan legalább egy új doktorandusz is részt vesz majd a projektben.