NKKP STARTING 152387

A projekt tartalmának bemutatása:

A hexaploid kenyérbúza (Triticum aestivum L., 2n=6x=42, AABBDD) a világ népességének mintegy 40%-a számára alapvető táplálékforrás, és a napi fehérje- és kalóriabevitel 20%-át biztosítja. Jelenleg a búza a világon a legszélesebb körben termesztett növény, több mint 218 millió hektáron termesztik. Az árpa (Hordeum vulgare L., 2n=2x=14, HH) az egyik első domesztikált növény, ma a takarmány- és malátatermesztés szempontjából kiemelkedő és a negyedik helyen áll a legfontosabb növényfajok rangsorában. A globális klímaváltozás okozta biotikus és abiotikus hatások mindkét gabonafaj termesztésére nyomást gyakorolnak. E sürgető kihívásoknak való megfeleléshez további intenzív nemesítésre van szükség, de a kívánt előnyös fenotípusok kialakítása nagyon időigényes, a búza genomjának hexaploid jellege és a génfunkciók nagyfokú redundanciája miatt, és egyes esetekben a génkapcsoltság lehetetlenné is teszi a nemesítést. A génszerkesztési technikák forradalmasították a növénytudományt és kiváló lehetőségeket nyitottak meg a növénytermesztés hatékonyságának javítására irányuló törekvésekben. A legtöbb esetben a genomszerkesztéssel létrehozott mutációk megkülönböztethetetlenek a természetben előforduló, vagy a kémiai- vagy sugárkezeléssel generált mutációktól, ezért az Európai Bizottság 2023. július 5-én jogalkotási javaslatot terjesztett elő, ahol két kategóriát különböztet meg az ÚjGenomikai Technikákkal kifejlesztett növények (NGT növények) között. Az NGT1 kategóriába tartoznának a hagyományosnemesítési eljárásokkal létrehozott növényekkel egyenértékű mutációkat tartalmazó, genomszerkesztési technikákkal előállított növények is. Mindezek fényében javasolt, hogy a genomszerkesztéssel létrehozott új tulajdonságokat a célgenom ideiglenes transzgenezise nélkül („DNA-free”) hajtsuk végre.
A CRISPR/Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein) technológia sokoldalú, egyszerű és olcsó megoldást kínál a DNS szekvenciaspecifikus in vivo módosítására, beleértve a géninaktiválást, a célzott mutagenezist, és a gén/allél cserét. A rendszer két komponensből áll: a DNS hasításért felelős Casfehérjéből; és a célszekvenciát kijelölő ’guide RNS’-ből. Az eljárás kettősszálú DNS töréseket (DSB) indukál és a sejthibajavítási mechanizmusait kihasználva vezet be mutációkat a célszekvenciába. Ezért a technológiával kiváltott fenotípusok nem igénylik transzgének jelenlétét, ám azok létrehozásához technológiailag egy átmeneti transzgénikus állapotot igényelnek, melynek során a növényben tartósan expresszálják a CRISPR/Cas-t kódoló géneket. A módosítások végrehajtását követően a beépített DNS-t a következő generációkban a szegregáció segítségével eltávolítják. A génátvitel során azonban kisebb DNS szakaszok beépülhetnek a kromoszómákba, amelyek azonosítása nehézkes és költséges vagyesetleg nem kívánt tulajdonságokat is létrehozhatnak. Ezek az események a technológia megítélése szempontjából aggályokat ébreszthetnek, ezért létrehoztak különböző, DNS-integrációt nem igénylő, tranziens technikákat, mint például aguide RNS/Cas ribonukleoprotein (RNP) biolisztikus bejuttatása szövettenyészetekbe, de ezek mutációs hatékonysága nagyon alacsony.
Kutatócsoportunk létrehozott egy genomszerkesztő rendszert búzában, amely a búza × árpa távoli keresztezés előnyeit használja ki. Az eljárás során az apai, árpa genomot használjuk a CRISPR/Cas rendszer hordozására, majd a hibridben történő búza genomszerkesztést követően búzával történő visszakeresztezéssel eltávolítjuk az árpa genomot az utódokból és a búza genomot újra diploid formába állítjuk. Előzetes eredményeink azt bizonyítják, hogy ez a rendszer, a hosszútávú génexpresszió biztosítása miatt, sokkal hatékonyabb a gabonákban eddig létező nyommentes genomszerkesztési technológiákhoz képest.
Kísérleteink során azt is megállapítottuk, hogy a búza x árpa hibridek in vitro mikroszaporításakor az anyai (búza)kromoszómák eliminációja is megtörténhet, ezért szeretnénk a rendszerünket fordított irányban is kipróbálni, ahol az anyai(búza) genom lenne a CRISPR/Cas rendszer hordozója, amelyet a mutációk kialakítását követően, spontán a szövettenyésztés során, vagy árpával történő visszakeresztezéssel távolítanánk el.
A projekt során szeretnénk jobban kihasználni ennek a hibridizációnak az előnyeit és nem csak véletlenszerű mutációkat, hanem precíz DNS cseréket, beillesztéseket kialakítani a búza genomban, amelyre a faj esetében kevés példa akad a szakirodalomban. A proof of concept kísérlet során egy deléciót tartalmazó RUBY riportergénnel transzformált búza növényt keresztezünk össze egy hőindukált CRISPR/Cas rendszert és egy DNS javító templátot tartalmazó árpa növénnyel. A hibridembriók in vitro mikroszaporítása közben hőkezeléssel indukáljuk a rendszert, melynek során a riportergén vágását követően a DNS javító templát segítségével helyreállítjuk annak expresszióját a sejt HDR (Homology-directed Repair)hibajavító mechanizmusán keresztül. A kidolgozandó technológia a jövőben lehetőséget adhat a búzagenom precízebb módosítására.
További célkitűzésünk megvizsgálni annak lehetőségét, hogy a CRISPR/Cas által, mindkét faj genomján indukált DSB-kkiválthatnak-e transzlokációkat a búza × árpa hibridben. Ehhez olyan guide RNS-eket tervezünk, amelyeknek mindkét genomon több (10-100 db) célszekvenciája van, majd hasonlóan a fenti kísérlethez, hőkezeléssel indukáljuk a CRISPR/Cas rendszert a szövettenyészetben. Ezután a regeneráns növényekben vizsgáljuk a homológ genomi szegmensek között, asejt HDR (homology-directed repair) mechanizmusán keresztül kialakult transzlokációkat. A gazdaságilag előnyös tulajdonságokat nyújtó transzlokációk pedig a későbbiekben előállíthatók lehetnek specifikus guide RNS használatával,melyek alapanyagként szolgálhatnak a nemesítés számára.