NKKP ADVANCED 152238

A projekt tartalmának bemutatása:

A gabonafélék, a Poaceae család tagjai, beleértve a búzát, a rizst, a kukoricát és az árpát, az élelmiszertermelés fő forrásai. Az éghajlatváltozás miatt szélsőséges hőmérséklet-ingadozások várhatóak a közeljövőben, amelyek hatással lehetnek haszonnövényeink termesztésére. A környezeti hőmérséklet emelkedése kedvezőtlenül befolyásolja a terméshozamot, a szemek száma és/vagy mérete és tömege csökkenhet, mivel az árpa és a búza is érzékeny a magas hőmérsékleti stresszre. A molekuláris mechanizmusok, amelyekkel az egyszikű növények a magas hőmérsékleti stresszre válaszolnak azonban kevéssé ismertek. Az árpa fontos célszervezet a gabonafélék genetikájának és epigenetikájának tudományos vizsgálatában. Nagy diploid genommal rendelkezik, amelynek teljes szekvenciája elérhető, nagymértékben rokon a búzával, a legfontosabb gabonafélével, amelynek genetikai és molekuláris vizsgálatai bonyolultak a rendkívül összetett hexaploid genomszerveződés miatt.
Az RNS-interferencia (RNSi) a cél-RNS-ek szekvencia-specifikus szabályozását végzi a kis méretű, jellemzően 20-24 nukleotid (nt) hosszú, nem kódoló szabályozó (s)RNS-eken keresztül, ilyenek a mikro (mi) és kis interferáló (si) RNS-ek. A növényekben a különböző RNSi útvonalak nélkülözhetetlen szerepet játszanak a különböző fejlődési folyamatokban és a biotikus és abiotikus stressz faktorokra adott válaszokban. A növényekben két fő RNSi útvonal létezik: a miRNS-ek jellemzően az endogén gének expressziójának szekvenciaspecifikus szabályozását közvetítik, míg a 24 nt siRNS-ek túlnyomórészt az RNS-indukált transzkripciós csendesítő komplexbe kerülnek, amely a transzpozonok és repetitív elemek, de novo DNS metilációjának (RNS-irányított DNS-metiláció (RdDM)) szabályozásával alapvető szerepet játszik a genom integritásának fenntartásában.
Fő célunk: Az RNSi szerepének és molekuláris hatásának megértése egy fontos egyszikű kultúrnövény, az árpa, fejlődési folyamataiban és hőstressz válaszaiban, elsősorban az RdDM útvonalra összpontosítva.
A javasolt kutatás racionalitását a CRISPR/Cas9 genomszerkesztési technológiával előállított árpa RdDM knock-out mutánsok vizsgálatából származó, előzetes kutatási adataink támasztják alá. Kísérleti eredményeink azt mutatják, hogy az árpában az RdDM útvonal komponensei fontos szerepet játszanak az alapvető fejlődési folyamatokban, például a kalász fejlődésében, valamint a hőstressz káros hatásainak enyhítésében. Az RdDM árpa mutánsok különböző fenotípusos jellegekkel társulnak, ami arra utal, hogy az RdDM útvonal egyes komponensei különböző, finoman beállított célpontokkal rendelkezhetnek és így specifikus biológiai folyamatokat szabályozhatnak.
A projekt fő célkitűzései: árpa RdDM knock-out vonalak létrehozása és fenotípusos elemzése a különböző RdDM komponensek biológiai szerepének és hatásmódjának szisztematikus feltérképezése érdekében. A már meglévő és az újonnan létrehozott null mutáns vonalakat - mutációnként legalább három független vonalat - fenotípusosan fogjuk elemezni, normál és hőstressz körülmények között. Az RdDM komponensek biológiai hatásainak vizsgálatára, konstitutív vagy endogén promóterek által vezérelt túltermelő vonalakat is létrehozunk. A promóter-riporter transzgenikus vonalak segítségével meghatározzuk a különböző célgének szövetspecifikus expresszióját, ami lehetővé teszi a további vizsgálatokra alkalmas kulcsfontosságú szövetminták azonosítását. Egyedi gyártású antitestek vagy transzgenetikusan expresszált jelölt célfehérjék felhasználásával végzett immunprecipitációs (IP) és kromatin IP (ChIP) kísérletek segítségével vizsgáljuk az RdDM végrehajtó fehérjék kis RNS-tartalmát és célzott genomi régióit, megkönnyítve ezzel a különböző RdDM útvonalak biológiai aktivitásának megértését. Az endogén kis szabályozó RNS-ek töltődésének megváltozását mutáns árpa vonalakban gélszűrési eljárással is vizsgálni fogjuk. Elfogjuk végezni a kis RNS és mRNS expressziós profilok mintázatának és a DNS-metiláció változásainak genom szintű elemzését mutáns növényekben optimális és hőstressz körülmények között. A kalász fejlődésében és a hőstresszre adott válaszokban részt vevő RNSi komponensek részletes molekuláris aktivitását elemezni fogjuk. Hőstressz tűrő és tulajdonságaiban megváltoztatott árpa vonalakat hozunk létre az azonosított RdDM komponensek mRNS expressziójának megváltoztatásával.
Kutatócsoportunk előnye, hogy már több kulcsfontosságú homozigóta árpa mutáns birtokában van, több független vonallal, és további mutánsok is a létrehozás korai szakaszában vannak. A mutáns vonalak részletes molekuláris vizsgálata elsősorban a meglévő mutánsokra fog összpontosítani, kereszt hivatkozva a többi meglévő vagy tervezett mutánsra. A csoport rendelkezik megfelelő szakértelemmel és szakértőkhöz való hozzáféréssel, hogy a kísérleteket sikeresen végrehajthassuk.
Tervezett munkánk összhangban van a világszerte tett azon erőfeszítésekkel, amelyek célja a modell organizmusokon szerzett biológiai ismeretek átültetése gazdaságilag fontos növényi rendszerekre. Az RdDM útvonal fő komponenseiről el fogjuk készíteni az első, részletes és hierarchikus funkcionális térképet, feltárva biológiai szerepüket árpában. A fontos, de technikailag nehéz célszervezet vizsgálatával reméljük, hogy az RdDM útvonal vagy általában az RNSi működéséhez kapcsolódó új kulcsfontosságú folyamatokat fogunk feltárni és megérteni. A szerzett ismereteinket felhasználva megkíséreljük az árpa minőségének és hőstressz tűrésének fokozását, és hosszú távon a megszerzett adatainkat búzára is átültetni.